Что представляет собой метод ПЦР 6 и что в него входит?

Возможные связанные заболевания и патологии:

Многие заболевания требуют создания новых, более чувствительных методов для своего определения. Многие из тех, что уже имеются, помогают в постановке диагноза, однако не всегда делают это достоверно. Точно диагностировать большинство инфекционных заболеваний в настоящее время может гнездовая ПЦР. Что же это за исследование?

Общие сведения о полимеразной цепной реакции

Впервые ПЦР стала использоваться в молекулярной биологии. Суть данной реакции заключается в следующем — увеличении количества ДНК-фрагментов в исследуемом растворе посредством реакции амплификации. Кроме того, данная реакция позволяет проводить искусственные мутации в определенных фрагментах наследственного материала, клонирование генов, исследование генетической информации.

исследование в лабораторииМетод заключается в копировании определенных фрагментов ДНК в специально созданных для этого условиях. Копируется только определенный фрагмент, так как его избирательность задается исследователем путем создания тех или иных условий среды и добавления определенных компонентов реакции (ферментов, промоторов и терминаторов).

Реакция позволяет амплифицировать небольшие участки ДНК (в отличие от реакции репликации, протекающей в живых организмах). В результате возникает среда с дочерними фрагментами ДНК, образованными на оригинальной матрице, полученной из биологического материала.

Анализ крови: что входит в обследование?

Обязательный состав компонентов данной реакции следующий:

  1. Матрица или участок, копии которого необходимо получить. Обычно в качестве матрицы выступает геном вирусной или бактериальной клетки (так как ПЦР обычно проводится с целью диагностики инфекционных заболеваний).
  2. Праймер — участок нуклеотидной цепи со свободной гидроксильной группой, при помощи которого начинается наращивание цепочки ДНК с 3-комплиментарного конца исследуемой ДНК.
  3. ДНК-полимераза. Основной фермент полимеразной цепной реакции. С его помощью происходит наращивание нуклеотидов в новообразованной цепи ДНК.
  4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
  5. Магний. При наличии данных ионов в растворе возможна активность ДНК-полимеразы.
  6. Буферная среда, в которой протекают все реакции.
  7. Высококипящие масла. Используются с целью предотвращения испарения реакционной среды.
  8. Пирофосфатаза. Применяется для увеличения образования клонов исследуемой ДНК (за счет ингибирования образования пирофосфата, который, в свою очередь, ингибирует образование клонов).

В основном проводится ПЦР с использованием двух пар праймеров — «гнездовая».

Обследование на инфекции, передаваемые половым путем

ПЦРВ настоящее время ПЦР получила широкое распространение в исследовании инфекций, передающихся половым путем (ИППП). Наиболее частой вариацией ПЦР является ПЦР-6 — реакция, направленная на выявление в исследуемом материале хламидий, уреаплазм, микоплазм и трихомонад. Реакция направлена на выделение их ДНК-компонентов (так как в отделяемом из половых путей не содержится их антигенов или продуктов метаболизма, ведь данные паразиты — внутриклеточные). Другие методы не используются, так как при их помощи возможно определение продуктов жизнедеятельности или самого микроорганизма в отделяемом из половых путей. Определенной информативностью еще обладает микроскопия мазка со специфической окраской или электронная микроскопия. Несмотря на это, для диагностики ИППП все же предпочитают использовать ПЦР.

Как и любая другая полимеразная реакция, ПЦР-6 на выявление ИППП протекает в 3 этапа:

  1. На первой стадии проводится нагревание исследуемой смеси до примерно 90 градусов (при данной температуре происходит денатурация цепи ДНК с разрывом межцепочечных связей). Нагревание проводится в течение 2-3 минут. С образованием одноцепочечных фрагментов первая стадия заканчивается и начинается следующая.
  2. На следующей стадии проводится постепенное охлаждение реакционной смеси для того, чтобы праймеры могли соединиться с нитями ДНК. Стадия носит название отжига. При неправильно подобранной температуре (золотым стандартом является температура примерно на 5 градусов ниже температуры плавления праймеров) возможно искажение результатов реакции и получение не тех участков ДНК, что планировалось (если температура ниже требуемой), или неспецифических компонентов реакции (при завышении температуры). Стадия длится примерно 30 секунд, за это время ДНК-полимераза уже образует несколько сотен пар нуклеотидов клона ДНК.
  3. На третьей стадии, стадии элонгации, происходит удлинение синтезированной цепи ДНК. Она проводится в два этапа: на первом этапе, который идет на протяжении 10 минут, происходит удлинение основной цепи клона, а на втором этапе, стадии финальной элонгации, достраиваются возможно присутствующие в растворе непарные одноцепочечные компоненты.

Как видно, время каждого из этапов достоверно известно, однако оно рассчитано для идеальных условий. Обычно же реакция может протекать и меньше либо больше заданного времени — это зависит от концентрации веществ, наличия матрицы.

Уникальность обследования

Особенностью гнездовой ПЦР является то, что на первом этапе образуется специальная часть молекулы ДНК — кДНК, которая служит матрицей для следующего этапа. Однако из-за возможного перекрестного взаимодействия часты случаи получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов.

пробирка с раствором в результате ПЦРВ результате всех проведенных этапов исследователь получает раствор с содержащимися в нем построенными на оригинальной матрице фрагментами ДНК. Количество их обусловлено временем всех этапов, количеством реагентов, условиями среды.

Обычно в растворе преобладают специфические продукты — фрагменты ДНК, обусловленные внедрением праймеров. Другие вещества и молекулы, образуемые в ходе реакции, специфическими не являются, так как для их образования праймеры не требуются. Несмотря на это, иногда они могут иметь решающее значение в постановке того или иного диагноза.

Диагностика ИППП, обусловленных внутриклеточными паразитами, проводится на основании наличия клиники, жалоб пациента. Для исследования берут мазок слизистой оболочки половых органов (в выделениях не всегда можно обнаружить, например, хламидий). Исключением является ситуация, когда достоверно известно, что в выделениях из половых органов присутствуют клетки слизистой оболочки.

Позже полученные мазки вносятся в среду, после чего и начинается реакция ПЦР. Ее ход ничем не отличается от стандартной: те же этапы, те же требующиеся вещества.

При определении инфекций, передающихся половым путем, использование крови для исследования обычно нецелесообразно, так как в очень редких случаях возбудитель проникает во внутреннюю среду организма (в таком случае возможно развитие других заболеваний, протекающих атипично (например микоплазменная или хламидийная пневмония, уреоплазменный менингит).

Результаты диагностики

Диагноз того или иного заболевания выставляется на основании определения специфической ДНК, характерной для того или иного микроорганизма (в настоящем случае генетического материала данных внутриклеточных возбудителей). Если результат отрицательный, не стоит сразу ставить отрицательный диагноз, так как реакция могла пойти не так, как надлежит, в результате чего начали образовываться не те фрагменты цепей ДНК. Ложноположительные результаты возможны в том случае, когда произошло перекрестное реагирование (т.е. цепь ДНК нормальной клетки могла мутировать с имитацией наличия микроорганизма). Однако обычно при соблюдении всех условий реакция протекает правильно, а ее чувствительность и специфичность практически равны 100%.

Несомненными преимуществами данной реакции является точность полученных данных, высокая чувствительность и специфичность, а также быстрота получения результатов (обычно исследование занимает не более одного дня).

Недостатками реакции является сложность соблюдения всех вышеуказанных условий, точность создания температурного и кислотного режима. Кроме того, для проведения данной реакции необходимо наличие сложного оборудования, приобрести которое способна не каждая лаборатория. Для идентификации полученных результатов требуется высококвалифицированный человек, осведомленный о ходе реакции, ее возможных продуктах и способный правильно интерпретировать полученную информацию с целью постановки правильного диагноза.

Обычно ПЦР на ИППП назначают в том случае, когда общеклиническим методом установить диагноз не удается. К таким методам относят общий анализ крови и мочи, биохимию крови, а также бактериологическое исследование (посев) при наличии секрета из половых путей.

В целом, ПЦР очень хороший метод для диагностики большинства заболеваний. Его высокая точность и специфичность позволяют определить практически любое инфекционное заболевание со стопроцентной достоверностью. Со временем данная методика обязательно войдет в минимальный перечень анализов для диагностики большинства заболеваний, связанных с инфекционным процессом и генетическими мутациями.

Возможно Вас заинтересуют Реклама на сайте ✆
загрузка...